Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/98739
Title: Novas espiro-β-lactamas com potente dupla atividade antimicrobiana
Authors: Alves, Nuno Alexandre Guerreiro
Orientador: Melo, Teresa Margarida Vasconcelos Dias de Pinho e
Simões, Carlos José Vieira
Keywords: Agentes anti-HIV; Agentes antiplasmodiais; Espiro-penicilanatos; Mecanismo de ação; Anti-HIV agents; Antiplasmodial agents; Spiro-penicillanates; Mechanism of action
Issue Date: 18-Oct-2021
Project: PD/BD/135287/2017
Abstract: O trabalho apresentado nesta tese de Doutoramento teve como principal objetivo a descoberta de novos espiropenicilanatos quirais com atividade antimicrobiana contra o vírus do HIV e Plasmodium, o parasita da malária. Este propósito foi alcançado através de uma estratégia com uma forte componente de modelação estrutural racional de um conjunto de espiro-β-lactamas previamente identificados como tendo uma potente bioatividade contra ambos os agentes patógenos. Este trabalho foi desenvolvido no seguimento de um estudo prévio de bioatividade de uma biblioteca de espiro-β-lactamas que permitiu a identificação de uma espiro-3H-pirazole-β-lactama BSS-593 e duas espirociclopentenil-β-lactamas análogas BSS-730A e BSS-722A, com uma promissora dupla atividade contra HIV e Plasmodium. A molécula BSS-730A revelou-se como a mais promissora da série, demonstrando uma notável atividade submicromolar contra várias estirpes do vírus HIV-1 e HIV-2, incluindo estirpes multirresistentes, e contra as fases hepática e sanguínea da infeção por Plasmodium. A identificação destas espiro-β-lactamas constituiu o ponto de partida para o presente projeto de Doutoramento, servindo estas como moléculas lead no design de novos espiropenicilanatos quirais potencialmente bioativos. A estes resultados altamente promissores sucederam-se um conjunto de estudos visando a descrição e interpretação do mecanismo de ação da molécula BSS-730A. Apesar de não ter sido possível identificar o alvo molecular da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A, os resultados obtidos indicam que esta exerce a sua atividade antiviral por um mecanismo complexo e diferente do mecanismo associado aos fármacos anti-HIV atualmente disponíveis no mercado. As modelações estruturais em torno da espiro-3H-pirazole-β-lactama identificada como tendo atividade contra HIV e Plasmodium, focaram-se no seu anel β-lactama, nos grupos substituintes do anel 3H-pirazole e no grupo ácido carboxílico do núcleo penicilanato. Neste contexto, foram utilizadas abordagens sintéticas variadas, nomeadamente a cicloadição 1,3-dipolar entre diazo-lactamas e alquinos deficientes em eletrões, desproteção seletiva de ésteres benzidrilos e conversão de ácidos carboxílicos a ésteres e ácidos hidroxâmicos. No caso específico da modelação do anel β-lactama, foi desenvolvida uma nova via sintética que resultou na síntese de novo de um núcleo estrutural γ-lactâmico bicíclico análogo da penicilina, a partir do aminóacido natural D-penicilamina. Esta estratégia sintética permitiu a síntese de um conjunto de derivados γ-lactâmicos, análogos da espiro-3H-pirazole-β-lactama bioativa. As novas moléculas sintetizadas pela modelação estrutural da espiro-β-lactama BSS-593 foram testadas para a sua atividade in vitro contra o vírus do HIV-1, permitindo a recolha de informações valiosas acerca da relação estrutura-atividade desta classe de espiro-β-lactamas, assim como sobre o seu potencial mecanismo de ação. Relativamente à classe das espirociclopentenil-β-lactamas, adotou-se uma estratégia de modelação estrutural preliminar em volta de diversos grupos substituintes da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A, assente em estratégias como a desproteção seletiva de ésteres benzidrilos e a cicloadição [3+2] formal entre 6-alquilidenopenicilanatos e 2-butinoatos ou alenoatos. Esta abordagem permitiu a identificação do éster benzilo da posição 2’ do anel ciclopenteno da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A como sendo suscetível a modelações estruturais, sem que estas comprometam significativamente a atividade antiviral e anti-Plasmodium dos derivados. A modelação de tal posição pela substituição do respetivo éster benzilo por pequenos ésteres alquílicos, nomeadamente um éster metílico e etílico, resultou na síntese de dois compostos com atividade nanomolar contra o HIV-1, e atividade micromolar contra Plasmodium berghei e Plasmodium falciparum. Adicionalmente, foi ainda possível identificar algumas características estruturais críticas para a atividade da classe das espirociclopentenil-β-lactamas. A identificação de dois novos compostos bioativos, obtidos através da modelação da posição 2’ do anel espirociclopenteno da espiro-β-lactama lead, serviu de base racional e impulsionadora a uma nova ronda de modelações estruturais focadas exclusivamente naquela posição, visando dotá-la com outros grupos éster variados, como são exemplo ésteres arílicos, ésteres alquílicos de cadeia longa ou ésteres benzílicos substituídos. Com este objetivo foi utilizada uma estratégia sintética exclusivamente baseada na cicloadição [3+2] formal entre um 6-alquilidenopenicilanato e diferentes alenoatos monossubstituídos. As novas espirociclopentenil-β-lactamas tiveram a sua atividade in vitro anti-HIV-1 determinada, o que resultou na identificação de seis moléculas adicionais com uma atividade antiviral nanomolar, de entre as quais duas demonstraram um notável valor de IC50 inferior a 20 nM. Por fim, foram estabelecidos dois protocolos computacionais diferentes, baseados em pesquisas de similaridade contra compostos bioativos de alvo molecular conhecido, com o intuito de recolher informações acerca do alvo molecular putativo da classe das espirociclopentenil-β-lactamas bioativas desenvolvidas ao longo deste trabalho. Este procedimento implicou a construção de uma base de dados interna contendo a estrutura e dados de bioatividade de cerca de 283 mil compostos com alvo molecular conhecido. Em suma, os estudos desenvolvidos no decurso desta tese de Doutoramento conduziram à síntese de uma biblioteca extensa de novas espiro-β-lactamas quirais, de entre as quais foi possível identificar um conjunto relevante de moléculas com uma notável atividade nanomolar contra o vírus do HIV-1. De entre as moléculas com atividade antiviral, todas aquelas cuja atividade anti-Plasmodium foi avaliada demonstraram também atividade contra o parasita. Este comportamento é concordante com o anteriormente observado para as moléculas lead, e é indicativo de que esta atividade antimicrobiana dupla possa ser transversal a todos os restantes espiropenicilanatos identificados como bioativos contra o vírus do HIV. Esta abordagem resultou ainda na recolha de uma elevada quantidade de informação que permitiu uma interpretação qualitativa extensa e compreensiva da relação de estrutura-atividade das classes de espiro-β-lactamas exploradas ao longo deste trabalho. Em termos de resultados relativos ao mecanismo de ação antiviral, focados na molécula lead ativa representativa da classe das espirociclopentenil-β-lactamas, associados à dupla atividade antimicrobiana observada, constituem uma indicação de que estas moléculas possam atuar ao nível do hospedeiro e, consequentemente, poderão demonstrar atividade contra outros agentes patógenos para além dos já explorados. No cômputo geral, os notáveis resultados de bioatividade e mecanismo de ação apresentados ao longo desta tese de Doutoramento, traduzem-se numa afirmação inequívoca do potencial farmacoterapêutico da classe das espiro-β-lactamas no panorama da saúde pública atual, justificando a aposta no seu desenvolvimento como uma possível alternativa às terapias antivirais e anti-malária atualmente disponíveis.
The main goal of this PhD thesis was the discovery of new chiral spiropenicillanates with antimicrobial activity against HIV and Plasmodium. This purpose was achieved through a strategy relying on rational structural modulation of a set of spiro-β-lactams previously identified as highly potent against the two pathogens. The present work was developed following a prior bioactivity study focused on a library of spiro-β-lactams which allowed the identification of a spiro-3H-pyrazol-β-lactam BSS-593 and two spirocyclopentenil-β-lactams BSS-730A and BSS-722A, displaying a promising dual activity against both HIV and Plasmodium. The most promising molecule, BSS-730A, presented a remarkable submicromolar activity against multiple strains of HIV-1 and HIV-2, including multidrug resistant strains, and against both hepatic and erythrocytic stages of Plasmodium infection. The identification of these spiro-β-lactams was the starting point for this PhD thesis, as these served as lead molecules for the rational design of new chiral spiro-β-lactams potentially bioactive. These highly promising preliminary results were followed by studies focused on determining the mechanism of action of the most promising molecule BSS-730A. Although it was not possible to identify its molecular target, the results suggest that spiro-β-lactam BSS-730A exerts its antiviral activity though a complex mechanism, different from those of the currently approved anti-HIV drugs. Spiro-3H-β-lactam BSS-593, active against HIV and Plasmodium, was target of structural modulations on its β-lactam ring, 3H-pyrazol ring substituents and carboxylic acid moiety. This approach comprised synthetic strategies such as 1,3-dipolar cycloaddition between diazo-lactams and electron-deficient alkynes, selective deprotection of benzhydryl esters and carboxylic acid conversion to an ester or an hydroxamic acid. Concerning the structural modulation of the β-lactam ring, an unprecedent synthetic route was developed, resulting in the de novo synthesis of a penicillin analogue γ-lactam bicyclic structural core, from the natural amino acid D-penicillamine. The previous synthetic approach allowed the synthesis of spiro-3H-pyrazol-γ-lactams analogues of BSS-593. All the new molecules synthesized through structural modulation of spiro-β-lactam BSS-593 were assayed for their in vitro activity against HIV-1, allowing the gathering of relevant information about the spiro-3H-pyrazol-β-lactams’ structure-activity relationship and mechanism of action. Concerning the synthesis of new spirocyclopentenyl-β-lactams, a preliminary structural modulation strategy was performed using BSS-730A as lead molecule. This strategy included synthetic approaches such as selective deprotection of benzhydryl esters and [3+2] annulation of 6-alkylidenepenicilanates with allenes or 2-butynoates. The benzyl ester present on position 2’ of BSS-730A’s cyclopentenene ring was identified as susceptible to structural modulations, since structural changes on this functional group did not significantly compromise the obtained derivatives’ bioactivity. In fact, the replacement of the benzyl ester with small alkyl esters, namely a methyl and an ethyl ester, afforded two new spirocyclopentenil-β-lactams with nanomolar activity against HIV-1 and micromolar activity against Plasmodium berghei and Plasmodium falciparum. Moreover, the later structural modulation strategy allowed the identification of some structural features which are critical for BSS-730A antiviral activity. These promising results led to a new round of structural modulations exclusively focused on position 2’ of BSS-730A’s cyclopentenyl ring, namely by endowing this position with different classes of esters, like aryl esters, long chain alkyl esters or substituted benzyl esters as the main examples. The new spirocyclopentenil-β-lactams were synthesized via [3+2] annulation of a 6-alkylidenepenicilanate with a set of different monosubstituted allenes. The new BSS-730A’s analogues were assayed for their in vitro anti-HIV-1 activity, being identified six additional molecules with nanomolar activity against HIV-1, among which two showed a remarkable IC50 value lower than 20 nM. Finally, two different computational approaches relying on similarity search were employed with the purpose of gathering information regarding the bioactive spiro-β-lactams putative molecular target. The former approach required the building of an internal database containing structural and bioactivity data of around 283 thousand bioactive compounds with known molecular target. In summary, the work developed during this PhD thesis led to the synthesis of an extensive library of new chiral spiro-β-lactams, among which was identified a set of molecules with a potent in vitro activity against HIV-1. Two of the spiro-β-lactams which displayed antiviral activity were tested for their antiplasmodial activity, proving to also inhibit both the parasite’s hepatic and blood infectious stage. Such behaviour agrees with the bioactivity profile observed for the lead molecules, suggesting that this dual antimicrobial activity may be transversal to all the identified bioactive spiro-β-lactams. Moreover, this approach allowed an extensive and comprehensive qualitative analysis and interpretation concerning the structure-activity relationship of the spiro-3H-pyrazol-β-lactams and spirocyclopentenil-β-lactams explored during this work. Studies focused on unveiling the lead molecule BSS-730A’s mechanism of action combined with the observed dual antimicrobial activity suggest that the bioactive spiro-β-lactams may display activity against other pathogens, apart from those already explored. Overall, the studies and respective results reported herein support the claim that the spiro-β-lactam’s class present a remarkable pharmacotherapeutic potential, justifying its further development as a possible alternative to currently available antiviral and antiplasmodial therapies.
Description: Tese de Doutoramento em Química, ramo de Química Médica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/98739
Rights: openAccess
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