Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/82295
Title: Expression of specific splicing isoforms in colorectal cancer as potential targets for delivery therapy
Other Titles: Expressão de isoformas de splicing específicas no cancro do cólon e recto como potenciais alvo para terapia dirigida
Authors: Hipólito, Ana Rita Crispim 
Orientador: Gomes, Célia Maria Freitas
Valeroso, Maria Cristina Mantas Albuquerque
Keywords: Cancro colorectal; TCF7L2; Vorinostato; 5-Azacitidina; 5-FU; Colorectal cancer; TCF7L2; Vorinostat; 5-Azacytidine; 5-FU
Issue Date: 1-Feb-2018
Serial title, monograph or event: Expression of specific splicing isoforms in colorectal cancer as potential targets for delivery therapy
Place of publication or event: Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil
Abstract: O cancro colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais frequente em homens e o segundo mais frequente em mulheres (Brandão and Lage, 2015). A etiologia do CCR é multifatorial e está relacionada com alterações genéticas esporádicas e hereditárias, em conjunto com a influência de fatores ambientais (Brandão and Lage, 2015), no entanto, as causas moleculares adjacentes a esta patologia continuam a ser um dos principais focos de investigação.O gene TCF7L2 participa na via de transdução de sinal WNT e é altamente expresso em células humanas derivadas de tumores colorretais (Angus-Hill et al., 2011). Mutações neste gene que promovem a perda de função do mesmo foram identificadas em casos de CCR esporádico, estando associadas a um aumento do crescimento celular descontrolado, indicando que alterações genéticas no gene TCF7L2 são importantes fatores para os processos de iniciação e progressão de CCR (Hrckulak et al., 2016).O gene TCF7L2 apresenta vários locais de splicing alternativo, levando à transcrição de diferentes isoformas (Weise et al., 2009). Dado que o conjunto de exões que compõe cada isoforma determina os domínios existentes na proteína resultante, a expressão de diferentes isoformas, com diferentes combinações de exões, tem diferente significado molecular e pode contribuir para o processo de carcinogénese de CCR.O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de transcritos alternativos do gene TCF7L2 em seis linhas celulares de CCR (HT29, LoVo, LS1745, HCT116, SW48, SW480) e vinte doentes diagnosticados com CCR mas sem causa molecular identificada. Várias isoformas não descritas na literatura foram identificadas nas linhas celulares e no DNA de doentes selecionados, revelando uma expressão diferencial deste gene nos dois tipos de amostra em estudo. Para que fosse possível perceber se variantes genéticas que pudessem estar presentes em locais chave deste gene poderiam interferir nesta expressão alternativa de isoformas, as mesmas amostras foram estudadas para a presença de sete conhecidos polimorfismos localizados na região promotora e nas regiões intrónicas 4 e 5 deste gene. O padrão de polimorfismos presente não pareceu estar diretamente relacionado com a expressão de transcritos alternativos.O processo de splicing alternativo está descrito como sendo regulado por modulação epigenética. Neste estudo, pretendemos também analisar o efeito de fármacos moduladores da ação epigenética (Vorinostato e 5-Azacitidina) na expressão destes transcritos alternativos em linhas celulares de CCR (HT29, LoVo, LS1745, HCT116, SW48, SW480) e a sua influência na viabilidade celular e na expressão de marcadores específicos nas mesmas. Os dois fármacos mostraram interferir na expressão de isoformas e na viabilidade celular e expressão de marcadores específicos. Em geral, o tratamento com Vorinostato pareceu interferir de forma mais eficaz nestes parâmetros.Neste estudo, tivemos também como objetivo estudar o efeito de terapia dirigida na linha celular HT29. As células foram tratadas com 5- Fluorouracil (5-FU) encapsulado em micropartículas (sintetizadas pelo laboratório de Tecnologia de processamento de nutracêuticos e bioativos (iBET)). O tratamento foi aplicado em várias concentrações e6analisado em três diferentes tempos de incubação (24 horas, 48 horas e 72 horas). Os resultados indicaram uma resposta dependente da dose aplicada e do tempo de incubação a que as células com tratamento foram sujeitas, existindo uma maior eficácia do tratamento quando aplicado em concentrações mais altas e com tempo de incubação de 72 horas. O tratamento com 5-FU encapsulado em micropartículas demonstrou resultados semelhantes ao tratamento com 5-FU livre e o tratamento com micropartículas vazias não interferiu na viabilidade celular, o que indicou que o tratamento com 5-FU encapsulado é tão eficaz quanto o tratamento convencional com o 5-FU não encapsulado e que este efeito não se deveu a qualquer influência por parte da concentração utilizada de micropartículas ou pela composição das mesmas.
Colorectal cancer (CRC) is the third most frequent type of cancer in men and the second in women (Brandão and Lage, 2015). Etiology of CRC is multifactorial, related to sporadic and hereditary genetic alterations gathered with environmental factors (Brandão and Lage, 2015), however, molecular causes for CRC continue to be a central subject of research.TCF7L2 gene participates in WNT signaling pathway and is highly expressed in CRC-human derived cells (Angus-Hill et al., 2011). Loss-of-function TCF7L2 mutations were found in sporadic CRC, being associated with increased cell growth, further confirming that TCF7L2 status is important for initiation and/or progression of CRC disease (Hrckulak et al., 2016). TCF7L2 gene has various sites of alternative splicing, originating different isoforms (Weise et al., 2009). Since the exon composition of TCFL2 isoforms determines the existing domains in the protein, different isoforms have different molecular meaning and may contribute to colorectal carcinogenesis.The aim of this study was to understand the expression of alternative transcripts of TCF7L2 gene in six CRC cell lines (HT29, LoVo, LS1745, HCT116, SW48, SW480) and twenty CRC patients without a known molecular cause for the disease. Several isoforms not yet described in the literature were identified in CRC cells and patients, leading to differential expression of this gene in CRC cell lines and in patients. To understand if genetic variants located in key points of this gene could interfere with this alternative splicing, CRC cell lines and patients were studied for seven TCF7L2 described polymorphisms in the promoter region of the gene and in flanking regions 4 and 5. The pattern of polymorphisms present did not seem to be directly correlated to the expression of alternative transcripts. Furthermore, alternative splicing is regulated by epigenetic modulation. In this study, we also aimed to understand if epigenetic modulating drugs (Vorinostat and 5-Azacytidine) could interfere with the expression of these alternative transcripts in CRC cell lines (HT29, LoVo, LS1745, HCT116, SW48, SW480) and could influence CRC cell viability and expression of specific markers. Treatment with both drugs seem to interfere with the expression of alternative TCF7L2 isoforms and affected cell viability and expression of specific markers. Overall, Vorinostat seemed to be more efficient in interfering with these features.Moreover, we aimed to study the effects of delivery therapy in HT29 cell line. CRC cells were treated with 5- Fluorouracil (5-FU) encapsulated in microparticles (synthesized by the Nutraceuticals and Bioactives Process Technology Lab (iBET)) in several concentrations and for three different time points (24 hours, 48 hours and 72 hours). Results showed a time/dose dependent response to treatment, presenting better efficiency after 72 hours of treatment in higher concentrations in HT29 cell line. Microparticle-encapsulated 5-FU showed similar results to free 5-FU, and blank microparticles did not affect cell viability, indicating that treatment with microparticle-encapsulated 5-FU is as effective as treatment with free 5-FU and that microparticle concentration or composition did not influence cell viability by its own.
Description: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
URI: http://hdl.handle.net/10316/82295
Rights: openAccess
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