Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/80745
Title: Synergistic roles of the proteasome and mitochondria in alpha-synuclein oligomerization : implications in Parkinson's disease
Authors: Branco, Diogo Alexandre Martins 
Orientador: Cardoso, Sandra Morais
Santos, Maria Cristina Januário
Keywords: Neurociências; Doença de Parkinson; Alfa-sinucleíca; Mitocôndrias; Transporte proteico
Issue Date: Feb-2012
Abstract: Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder, characterized by selective loss of nigrostriatal dopaminergic neurons and presence of intracellular insoluble proteinaceous inclusions, known as Lewy Bodies. Although PD etiopathogenesis remains elusive, the leading hypothesis establishes that mitochondrial dysfunction, protein quality control system deficiency, and protein oligomerization are major events that act synergistically to cause this devastating disease. The main goal of this work is to study ubiquitin-proteasome system (UPS) and ubiquitin dependent alpha-synuclein (aSN) clearance in different PD cellular models with mitochondrial deregulation. We used three different PD cellular models: SH-SY5Y ndufa2 knock-down (KD) cells, PD cybrids and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with diagnostic of PD. For each model we studied proteasome activity, using fluorimetric analysis, and quantified cellular ubiquitination and aSN aggregation by Western Blot. We used lactacystin as negative control of proteasomal function. In PBMC of PD patients population we proceed to evaluate aSN secretion to plasma by Dot Blot and the influence of several demographic characteristics in the above mentioned determinations. SH-SY5Y ndufa2 KD cells shown a proteasome activity up-regulation with increased levels of total ubiquitination, ubiquitin monomers and aSN oligomers as compared with SH-SY5Y parental cells. PD Cybrids did not show differences concerning proteasome enzymatic activity. PBMC of patients do not exhibit statistical significant differences in proteasome activity compared to age-matched controls. However, there is a negative correlation of both chymotrypsin-like activity and total ubiquitin content with age in control and LOPD groups. Despite there are no statistical significant differences in ubiquitin levels between patients and controls, total ubiquitin content increases and is positively correlated with chymotrypsin-like activity and with aSN oligomers levels. aSN levels in plasma are slightly increased in LOPD and significantly increased in EOPD. Thus, we conclude that in SH-SY5Y ndufa2 KD cells there is an up-regulation of proteasomal enzymatic activity that could mean an interesting cell rescue attempt. Moreover, although ubiquitinated proteins content are increased in the other two models, proteasome activity is not significantly altered, what is compatible with an over request of UPS due to high rate of protein misfolding or somehow a compromise in the UPS pathway, upstream the enzymatic core. We also conclude that in PBMC of both patients and control individuals, there is a decrease of UPS activity with age. In addition, aSN oligomers are ubiquitinated and we identified an ubiquitin-dependent clearance insufficiency. Secretion of aSN in PBMC seems to be a cell mechanism to prevent its cellular accumulation.
A Doença de Parkinson (PD) é a doença neurodegenerativa do movimento mais comum sendo caracterizada pela perda selectiva de neurónios dopaminérgicos nigro-estriatais e pela presença de inclusões proteicas intracelulares insolúveis, os Corpos de Lewy. Apesar de a etiopatogenia não estar completamente esclarecida, existem evidências que apontam para que a disfunção mitocondrial, um ineficiente sistema de controlo de qualidade proteica e a oligomerização proteica sejam eventos fundamentais que actuam de forma sinérgica causando esta doença. O principal objectivo deste trabalho é estudar o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) e a degradação de alfa-sinucleina (aSN) dependente de ubiquitina em diferentes modelos de PD com disfunção mitocondrial. Foram usados três modelos de PD: células SH-SY5Y ndufa2 knock-down (KD), PD Cybrids e células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de indivíduos com diagnóstico de PD. Para cada modelo, estudámos a actividade do proteassoma, usando análise fluorimétrica. Por Western Blot, quantificámos a ubiquitinação e agregação de aSN. Os dois primeiros modelos foram incubados com lactacistina, condição que desempenha o papel de controlo negativo para a função do proteassoma. Nas PBMC dos doentes quantificámos a secreção de aSN para o plasma através de Dot Blot e procurámos influências demográficas nas determinações acima mencionadas. As células SH-SY5Y ndufa2 KD apresentam aumento da actividade do proteassoma com níveis aumentados de ubiquitinação, monómeros de ubiquitina e oligomeros de aSN comparando com a linha parental SH-SY5Y. Os PD Cybrids não mostram diferenças no que respeita a actividade do proteassoma As PBMC dos doentes não têm diferenças estatisticamente significativas na actividade do proteassoma comparadas com as de controlos de idade aproximada. Contudo, existe uma correlação negativa com a idade nos grupos controlo e LOPD, quer da actividade “chymotrysin-like” do proteassoma, quer do conteúdo total de ubiquitina. Apesar de não existirem diferenças estatisticamente significativas nos níveis de ubiquitina entre doentes e controlos, o conteúdo total de ubiquitina está aumentado e está positivamente correlacionado com a actividade “chymotrysin-like” bem como com os níveis de oligomeros de aSN. Os níveis de aSN no plasma estão discretamente aumentados nos doentes LOPD e de forma significativa nos EOPD. Assim, concluímos que nas células SH-SY5Y ndufa2 KD existe um mecanismo de activação do proteassoma que pode significar uma tentativa interessante de sobrevivência celular. Além disso, apesar do conteúdo de proteínas ubiquitinadas também estar aumentado nos outros dois modelos, o mesmo não se pode afirmar face à actividade enzimática do proteassoma, o que pode corresponder a um aumento da função do UPS devido a uma concentração aumentada de proteínas disfuncionais ou de certa forma um compromisso da via do UPS, acima do complexo enzimático central. Concluímos também que existe diminuição da actividade do UPS com a idade nas PBMC, quer dos doentes quer dos indivíduos controlo. A aSN oligomerizada está ubiquitinada possivelmente devido a uma insuficiência da degradação dependente de ubiquitina. Por último, a secreção de aSN nas PBMC parece ser um mecanismo para prevenção da sua acumulação intracelular
Description: Trabalho final de mestrado integrado em Medicina área científica de Neurociências, apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/80745
Rights: openAccess
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