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Title: Von Willebrand factor and ADAMTS13 : Duality in hemorrhagic and thrombotic disease
Authors: Fidalgo, Teresa de Jesus Semedo 
Orientador: Cristovão, Armando
Ribeiro, Maria Letícia
Keywords: Gene mutations; Von Willebrand disease; Von Willebrand factor; Thrombotic thrombocytopenic purpura; Atypical haemolytic uraemic syndrome; ADAMTS13; Complement; Molecular biology methods; Next-generation sequencing; Mutações; Doença de von Willebrand; Fator de von Willebrand; Púrpura trombótica trombocitopénica; Síndrome hemolítico urémico atípico; ADAMTS13; Complemento; Métodos de biologia molecular; Sequenciação de nova geração
Issue Date: 10-Jul-2017
Citation: FIDALGO, Teresa de Jesus Semedo - Von Willebrand factor and ADAMTS13 : duality in hemorrhagic and thrombotic disease. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW:
Abstract: Haemostasis is a normal defence mechanism that requires the combined activity of vascular, platelet and plasma factors. Under physiologic conditions, a haemostatic balance is achieved through the effects of natural procoagulant and anticoagulant factors which, in equilibrium with each other, provide haemostasis at the sites of vascular injury. Abnormalities of these haemostasis factors can lead to excessive bleeding or thrombosis. One of the key players in both processes is the von Willebrand factor (VWF), an adhesive glycoprotein of large dimensions with crucial functions in haemostasis derived from its ability to organise in multimers. The high-molecular-weight multimers (HMWM) of VWF are essential for primary haemostasis, mediating a molecular endothelium–platelet bridge for binding collagen and the platelet receptors glycoprotein (GP), GPIb and GPIIb/IIIa. In addition, VWF binds and stabilises factor VIII (FVIII) in the circulation, protecting it from rapid proteolytic degradation while delivering it to sites of vascular damage. Once secreted into the blood, VWF multimers are subject to competing processes of clearance and of proteolysis by ADAMTS13 (A Disintegrin And Metalloproteinase with a ThromboSpondin type 1 motif, member 13). The unusually large multimers of VWF are, under normal conditions, cleaved by ADAMTS13 to smaller, less adhesive multimers. As a result of this physiological process, VWF insufficiencies may cause haemorrhage by reducing platelet function, or by reducing the FVIII concentration. Abnormalities in VWF secretion, intravascular clearance of VWF, the assembly of VWF multimers, or exaggerated proteolytic degradation by ADAMTS13 can cause diverse forms of von Willebrand disease (VWD). Conversely, defects in proteolysis of VWF by ADAMTS13 can cause thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), a disease caused by the clumping of platelets by ultra-large VWF and defined clinically by microangiopathic hemolytic anaemia and thrombocytopenia. There are two main forms of thrombotic microangiopathies (TMAs) that have overlapping clinical phenotypes: TTP and atypical haemolytic uraemic syndrome (aHUS). Conceptually, TTP has been distinguished from aHUS by more common neurological manifestations, whereas in aHUS, renal involvement is more pronounced. However, this rule is not always reliable; some aHUS patients have neurological complications and some TTP patients have renal failure. Over the last decade, noteworthy progress has been made to improve the clinical and laboratory approaches to predict the expected signs and symptoms, patient outcome and genotype-phenotype correlations. Despite this, the differential diagnosis of TTP/aHUS remains challenging. While TTP is characterised by a severe deficiency of ADAMTS13, aHUS is characterised by hyperactivation of the alternative complement pathway resulting from either a loss-of-function mutation in a regulatory gene, CFH, CFI, CD46 (MCP) or THBD, or a gain-of-function mutation in an effector gene, CFB or C3. The molecular analysis of VWF, ADAMTS13 and complement genes are very useful in the diagnosis of VWD and differential diagnosis of TTP/aHUS. To better understand the clinical variability, which is found even within families, it is necessary to characterise the mutational profile. Nevertheless, up to now, the molecular analysis of VWF and genes implicated in TMAs was not affordable by diagnostic laboratories due to the high costs involved in the study of multiple genes by conventional Sanger DNA sequencing. The advent of next-generation sequencing (NGS) is changing this paradigm since NGS allows for simultaneous sequencing of large gene panels and generates competitive results at a lower cost and in a shorter period of time. With this in mind, we conducted a study in a haemorragic disease (VWD) and a thrombotic disease (TTP/aHUS) with two main objectives: first, to expand our understanding of the molecular basis of different types of VWD, TTP and aHUS and establish phenotype-genotype correlations; second, to develop a diagnosis workflow based on VWF/ADAMTS13 activity and screening of mutations using a custom NGS gene panel. This approach allowed for the creation of a new algorithm that uses an efficient and cheaper methodology to establish the diagnosis, prognosis and more accurate treatment for these diseases. First, we conducted a study to determine the correlations between genotype and phenotype in 92 Portuguese individuals from 60 unrelated families with VWD; therefore, we directly sequenced VWF. We compared the classical Sanger sequencing approach and NGS to assess the value-added effect on the analysis of the mutation distribution in different types of VWD. Sixty-two different VWF mutations were identified, 27 of which had not been previously described. NGS detected 26 additional mutations, contributing to a broad overview of the mutant alleles present in each VWD type. Twenty-nine probands (48.3%) had two or more mutations; in addition, mutations with pleiotropic effects were detected, and NGS appropriately classified seven of them. Furthermore, the differential diagnosis between VWD 2B and platelet type VWD (n = 1), Bernard-Soulier syndrome and VWD 2B (n = 1), and mild haemophilia A and VWD 2N (n = 2) was possible. Next, we evaluated two VWF dysfunctions that could be underdiagnosed: VWF collagen-(types III and VI) binding defects and acquired von Willebrand syndrome (AVWS) in hematologic malignancies. The functional and molecular studies focused on VWF collagen-binding defects reported VWF sequence variations that may not interfere with VWF functional screening assays showing normal values, and can only be detected using type VI collagen. This analysis in our cohort of nine patients, albeit small, indicated that a laboratory approach based on the correlation of type III and type VI collagen-binding assays and molecular studies is indispensable for a more accurate diagnosis of type 2M VWD. Moreover, the detection of the specific type VI collagen-binding defect may contribute to the correct diagnosis of patients with mild bleeding disorders that are often classified as having an undefined cause. AVWS is a relatively uncommon and under-diagnosed acquired bleeding disorder, and it occurs in individuals with no personal or familial history of bleeding diathesis. AVWS is usually associated with an underlying disorder, namely lymphoproliferative disorders, cardiovascular diseases, myeloproliferative neoplasms, other cancers and autoimmune diseases. The diagnosis is challenging because it greatly depends on clinical suspicion. On the other hand, the tests used to assess AVWS are the same as those for VWD, and the differential diagnosis between both can sometimes be difficult. We studied six patients with AVWS and different underlying diseases: Waldenstrom’s Macroglobulinemia (WM), Marginal Zone Lymphoma (MZL), Chronic Myeloid Leukaemia (CML) and Essential Thrombocythemia (ET). The clinical‐laboratory correlation in the six cases led to the diagnosis of AVWS. The detection of low VWF levels in two patients came before the diagnosis of the underlying lymphoproliferative disease. In another patient, the detection of the VWF variant could have led to a misdiagnosis, in this case, a congenital VWD. However, the discordant genotype-phenotype correlation and late haemorrhagic manifestation led to the suspicion of simultaneous AVWS. Including an evaluation of VWF analysis in late haemorrhagic episodes and/or in AVWS-associated disorders enhanced the efficacy of AVWS diagnosis, leading to a more tailored management approach in each patient. Finally, we analysed genotype-phenotype correlations in 45 patients (11 TTP and 34 aHUS) based on the impact of the predicted pathogenicity of each variant found and the co-inherited known genetic risk factors for TMAs. In total, 33 different rare variants, eight of which novel (in ADAMTS13, CFH and CD46), were identified across seven genes. The eleven TTP patients were homozygous (n = 6), compound heterozygous (n = 2) and heterozygous (n = 3) for 10 ADAMTS13 variants (six pathogenic mutations). Among the 34 aHUS patients, 17 were heterozygous for 23 variants in the different complement genes with distinct consequences, ranging from single pathogenic mutations associated with complete disease penetrance to benign variants that cause aHUS only when combined with other variants and/or CFH and CD46 risk haplotypes or CFHR1-3 deletion. Our study provides evidence of the usefulness of the NGS panel as an excellent technology that enables more rapid diagnosis of TMAs, and is a valuable asset in clinical practice to discriminate between TTP and aHUS. The custom NGS panel has made it easier to study VWF, ADAMTS13 and the complement genes. Moreover, this technology has changed the paradigm of routine molecular studies: in the face of multiple genetic changes found in every patient, the critical challenge became discriminating disease-associated variants from the broader background of variants present in all patients’ genomes. This analysis led us to a well-established bioinformatics pipeline according to NGS guidelines, and evidences that a clinical-laboratory approach for each patient’s genotypic data must be evaluated with consideration of their specific and differential clinical manifestations. In conclusion, the study of these 144 patients contributes to a better understanding of the molecular genetics of VWF, ADAMTS13 and complement gene-related phenotypes. Moreover, it provides evidence of the usefulness of the NGS panel as an excellent and advantageous technology that enables more rapid and cost-effective diagnosis. These findings show that this is a valuable asset in clinical practice given that a correct diagnosis is essential for determining the most effective treatment for each patient with these complex diseases.
A hemostase é um mecanismo de defesa que requer a atividade combinada do endotélio, plaquetas e fatores plasmáticos. Sob condições fisiológicas, o equilíbrio hemostático é conseguido através da atividade dos fatores procoagulantes e anticoagulantes naturais que, em equilíbrio entre si, proporcionam a formação de um tampão hemostático nos locais de lesão vascular. Alterações destes fatores hemostáticos podem dar origem a hemorragia ou trombose. Um dos principais intervenientes em ambos os processos é o factor von Willebrand (FVW), uma glicoproteína adesiva de grandes dimensões com funções cruciais na hemostase devido à sua capacidade de se organizar em multímeros. Os multímeros de alto peso molecular (MAPM) do FVW são essenciais para a hemostase primária, ao mediar uma ponte molecular de endotélio-plaqueta para ligação ao colagénio e aos recetores plaquetares glicoproteína (GP) Ib e GPIIb/IIIa. Além disso, o FVW liga e estabiliza o factor VIII (FVIII) na circulação, protegendo-o da rápida degradação proteolítica, ao mesmo tempo que o distribui para os locais de lesão vascular. Uma vez na corrente sanguínea, os multímeros do FVW são submetidos a processos de clearance e de proteólise pela enzima ADAMTS13 (A Disintegrin And Metalloproteinase with a ThromboSpondin type 1 motif, member 13). Os multímeros do FVW de grandes dimensões são, em condições normais, clivados pela ADAMTS13 em multímeros mais pequenos e menos adesivos. Como resultado deste processo fisiológico, deficiências no FVW podem causar hemorragia por redução da função plaquetar ou por redução da concentração do FVIII. Anomalias na secreção do FVW, clearance intravascular, formação dos multímeros, ou a degradação proteolítica excessiva pela ADAMTS13 podem dar origem a diversas formas da doença de von Willebrand (DVW). Por outro lado, as deficiências na proteólise do FVW pela ADAMTS13 podem originar púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), uma doença causada por aglomerados de plaquetas e MAPM do FVW, e que se apresenta clinicamente com trombocitopenia e anemia hemolítica microangiopática. Existem duas formas principais de microangiopatias trombóticas (MATs) que têm fenótipos clínicos sobrepostos: PTT e síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa). Conceitualmente, a PTT tem sido diferenciada do SHUa por ter manifestações neurológicas mais frequentes, enquanto no SHUa o envolvimento renal é mais pronunciado. No entanto, esta regra nem sempre é fiável: alguns doentes com SHUa, apresentam complicações neurológicas e alguns doentes com PTT apresentam insuficiência renal. Ao longo da última década foram feitos progressos notáveis para melhorar a abordagem clinico-laboratorial, para identificar sinais e sintomas, estabelecer o prognóstico dos doentes e analisar a correlação genótipo - fenótipo. Apesar disso, o diagnóstico diferencial PTT/SHUa ainda é um desafio. Embora a PTT seja caracterizada por uma deficiência grave de ADAMTS13, o SHUa resulta da hiperactivação da via alternativa do complemento devida a uma mutação com perda-de-função num dos genes reguladores, CFH, CFI, CD46 (MCP) ou THBD, ou de uma mutação com ganho-de-função num gene efetor, CFB ou C3. A análise molecular do VWF, ADAMTS13 e genes do complemento é muito útil no diagnóstico da DVW e diagnóstico diferencial de PTT/SHUa. Para melhor compreender a variabilidade clínica, inclusivé dentro da mesma família, é necessário caracterizar o perfil mutacional. Contudo, até agora, a análise molecular do VWF e dos genes implicados nas MATs não estava acessível aos laboratórios de diagnóstico devido aos elevados custos envolvidos no estudo de múltiplos genes pelo método convencional de sequenciação do DNA (Método de Sanger). O aparecimento da sequenciação de nova geração (NGS-next generation sequencing) está a alterar este paradigma, uma vez que a NGS permite a sequenciação simultânea de grandes painéis de genes e gera resultados competitivos a um custo mais baixo e num curto período de tempo. Baseados nestes dados, realizámos um estudo numa doença hemorrágica (DVW) e numa doença trombótica (PTT/SHUa) com dois objetivos principais: 1) alargar o nosso conhecimento sobre a base molecular dos diferentes tipos de DVW, PTT e SHUa e estabelecer correlações genótipo – fenótipo; 2) desenvolver uma estratégia de diagnóstico com base na atividade de FVW/ADAMTS13 e desenhar um painel de genes para efetuar a pesquisa de mutações por NGS. Esta abordagem permitiu-nos criar um novo algoritmo de estudo, que utiliza uma metodologia eficiente e mais barata, e que permite estabelecer o diagnóstico e o prognóstico e contribui para uma melhor definição da estratégia terapêutica destas patologias. Em primeiro lugar, realizámos um estudo para determinar as correlações entre o genótipo e o fenótipo em 92 indivíduos Portugueses, de 60 famílias não relacionadas com DVW; assim, sequenciámos diretamente o VWF. Comparámos a abordagem clássica de sequenciação de Sanger e a metodologia NGS para avaliar a mais-valia na análise de mutações nos vários tipos de DVW. Foram identificadas 62 mutações diferentes no VWF, 27 das quais não tinham sido previamente descritas. A NGS detetou 26 mutações adicionais, contribuindo para uma perspetiva alargada dos alelos mutados presentes em cada tipo de DVW. Vinte e nove propósitos (48,3%) apresentavam uma ou mais mutações; além disso, foram detetadas mutações com efeitos pleiotrópicos, tendo a NGS classificado adequadamente sete delas. Foi ainda possível o diagnóstico diferencial entre DVW 2B e DVW tipo plaquetar (n=1), síndrome de Bernard-Soulier e DVW 2B (n=1) e hemofilia A ligeira e DVW 2N (n=2). De seguida, avaliamos duas disfunções do FVW que poderiam estar a ser subdiagnosticadas: defeitos de ligação FVW-colagénio (tipos III e VI) e síndrome de Von Willebrand adquirida (SVWA) em doenças hemato-oncológicas. Os estudos funcionais e moleculares incidiram nas alterações de ligação ao colagénio associados a variações da sequência do VWF que podem não interferir nos testes funcionais de screening, que apresentam valores normais, e que só podem ser detetados utilizando colagénio tipo VI. Esta análise no nosso grupo de nove doentes, apesar de pequeno, indicou que uma abordagem laboratorial baseada na correlação entre os ensaios de ligação ao colagénio tipo III e tipo VI e os estudos moleculares é indispensável para um diagnóstico mais preciso da DVW tipo 2M. Além disso, a deteção dos défices específicos da ligação ao colagénio tipo VI pode contribuir para o diagnóstico de doentes com perturbações hemorrágicas ligeiras que muitas vezes são classificados com tendência hemorrágica de causa desconhecida. SVWA é uma patologia hemorrágica adquirida, subdiagnosticada e relativamente pouco frequente, que ocorre em indivíduos sem história pessoal ou familiar de diátese hemorrágica. SVWA está geralmente associado com uma patologia subjacente, nomeadamente doenças linfoproliferativas, doenças cardiovasculares, neoplasias mieloproliferativas, outros cancros e doenças autoimunes. O diagnóstico é desafiador porque depende muito da suspeita clínica. Por outro lado, os testes usados para diagnosticar o SVWA são os mesmos utilizados para o diagnóstico da DVW, e a distinção entre as duas patologias pode ser difícil. Avaliámos seis doentes com SVWA e diversas patologias subjacentes: Macroglobulinemia de Waldenstrom (MW), Linfoma de Zona Marginal (LZM), Leucemia Mielóide Crónica (LMC) e Trombocitémia Essencial (TE). A correlação clínica – laboratorial nos seis casos permitiu o diagnóstico de SVWA. A deteção de níveis baixos de FVW em dois doentes ocorreu antes do diagnóstico da doença linfoproliferativa subjacente. Noutro doente, a deteção da variante de VWF poderia ter levado a um diagnóstico incorrecto de DVW congénita. No entanto, a correlação genótipo - fenótipo discordante e a manifestação hemorrágica tardia, levou à suspeita da presença concomitante de SVWA. Incluir uma avaliação da análise do VWF em episódios hemorrágicos tardios e/ou em doenças associadas com SVWA aumentou a eficácia do diagnóstico de SVWA, e permitiu uma estratégia terapêutica mais individualizada. Finalmente, analisámos as correlações genótipo-fenótipo em 45 pacientes (11 PTT e 34 SHUa) com base no impacto da patogenicidade prevista para cada variante encontrada e dos fatores hereditários de risco genético para MATs. No total, foram identificadas 33 variantes raras diferentes em sete genes, oito das quais descritas pela primeira vez (em ADAMTS13, CFH e CD46). Os onze doentes com PTT eram homozigóticos (n=6), heterozigóticos compostos (n=2) e heterozigóticos (n=3) para 10 variantes ADAMTS13 (seis mutações patogénicas). Entre os 34 doentes com SHUa, 17 eram heterozigóticos para 23 variantes nos diferentes genes do complemento com consequências distintas, desde mutações patogénicas únicas associadas com penetração completa da doença, a variantes benignas que apenas causam SHUa quando associadas a outras variantes e/ou haplótipos de risco CFH e CD46 ou delecção CFHR1-3. O nosso estudo evidencia a utilidade do painel NGS como uma excelente tecnologia que permite um diagnóstico mais rápido de MATs, e uma mais-valia na prática clínica para discriminar entre PTT e SHUa. O painel NGS personalizado tornou mais fácil o estudo do VWF, ADAMTS13 e dos genes do complemento. Além disso, esta tecnologia mudou o paradigma dos estudos moleculares de rotina: face às múltiplas alterações genéticas encontradas em cada doente, o desafio principal foi discriminar as variantes associadas com a doença de entre as variantes presentes no genoma de todos os doentes. Esta análise levou-nos a um algoritmo bioinformático bem estabelecido, de acordo com as guidelines NGS, e à demonstração de que os dados do genótipo de cada doente devem ser avaliados numa abordagem clínico – laboratorial, tendo em conta as suas manifestações clínicas específicas. Em conclusão, o estudo destes 144 doentes contribui para um melhor entendimento da genética molecular de VWF, ADAMTS13 e dos genes do complemento, assim como dos fenótipos associados. Além disso, evidencia a utilidade do painel NGS como uma tecnologia excelente e vantajosa que permite um diagnóstico mais rápido e mais económico. Estes resultados mostram ainda que esta estratégia é uma mais-valia na prática clínica dado que um diagnóstico correto é determinante na escolha da melhor estratégia terapêutica para cada um destes doentes com patologias tão complexas.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
Rights: openAccess
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