Avaliação da capacidade de transporte e entrega de material genético associada a diferentes nanossistemas de base polimérica

Abstract

A terapia génica é uma estratégia terapêutica bastante promissora, que permite não só tratar, como também prevenir ou eliminar as causas de uma patologia, alterando o atual paradigma da medicina. Esta modalidade terapêutica tem sido aplicada em diversas patologias, de origem hereditária ou multifactorial. No entanto, o desenvolvimento de sistemas de transporte e entrega de material genético seguros e eficazes continua a ser um dos principais desafios para a sua implementação clínica. Embora a eficácia dos vetores não-virais seja inferior à dos vetores baseados em vírus, estes apresentam algumas vantagens, quando comparados com os vetores virais, como por exemplo a baixa imunogenicidade, facilidade de produção, estabilidade, e a capacidade de transportar sequências nucleotídicas maiores. Entre os vectores nãovirais, os sistemas de base polímérica têm-se revelado vetores bastante promissores para o transporte e entrega de material genético, destacando-se pela sua versatilidade, pela variedade de métodos de síntese disponíveis e pela facilidade de funcionalização química, que permitem a optimização da sua relação estrutura/atividade, a fim de incrementar a eficácia do nanossistema. Nexte contexto, o objectivo deste trabalho consistiu em desenvolver um nanossistema de transporte e entrega de material genético de base polimérica, eficaz e inovador, que induzisse uma elevada expressão do transgene, aliada a uma reduzida citotoxicidade. Deste modo, avaliou-se atividade biológica de poliplexos baseados no polímero poli(metacrilato de 2-aminoetil) (PAMA), com diferentes pesos moleculares e copolimerizado com o polietilenoglicol (PEG). Foram também avaliados outros parâmetros como a sua citotoxicidade e a capacidade de condensação do ADN. Os resultados obtidos, na presença de soro, demonstraram que os copolímeros em bloco PEG-b-PAMA, promovem a formação de poliplexos com uma capacidade de transfeção superior à dos poliplexos baseados, exclusivamente, nos homopolímeros PAMA correspondentes. A copolimerização com o PEG promoveu, também, a diminuição da citoxicidade dos poliplexos. Ainda assim, e embora os poliplexos baseados no copolímero PEG-b-PAMA28900 demonstrassem uma eficácia de transfeção bastante superior à obtida com a referência padrão dos sistemas de base polimérica, a polietilenimina ramificada (bPEI), estes nanossistemas induziram níveis de citotoxicidade demasiado elevados, que comprometem a sua aplicação in vivo. Assim sendo, posteriormente, foi avaliada a capacidade de transporte e entrega de material genético de poliplexos baseados na combinação dos polímeros poli(metacrilato de etilo-2-dimetilamino) (PDMAEMA) e poli(β-amino éster) (PβAE), em diferentes proporções. Para tal, avaliou-se a atividade biológica e a citotoxicidade das formulações em várias linhas celulares e analisou-se o seu mecanismo de internalização celular. Procedeu-se ainda à caracterização físico-química das formulações preparadas com a combinação mais promissora, tendo sido avaliado o tamanho, a carga superficial e a capacidade de condensação/proteção do ADN. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação dos polímeros PDMAEMA e PβAE conduz à formação de poliplexos que tem a capacidade de entregar o material genético no núcleo. Os poliplexos preparados com a combinação PDMAEMA:4PβAE, na razão de carga N/P 25/1, foram selecionados como a melhor formulação, devido à sua elevada capacidade de transfeção, mesmo na presença de soro, e aos reduzidos níveis de citotoxicidade. Adicionalmente, os outros ensaios experimentais demonstraram que os poliplexos baseados nesta combinação de polímeros são internalizados, maioritariamente, por endocitose mediada por clatrinas, promovendo a expressão do transgene numa elevada percentagem de células. Para além disso, estes nanossistemas apresentam uma elevada proteção de material genético e um tamanho reduzido, características estas favoráveis à sua aplicação in vivo.

Gene therapy is a very promising therapeutic strategy that allows not only to treat but also to prevent or eliminate the causes of a disease, changing the current medicine’s paradigm. This therapeutic technique has been applied in several pathologies, from hereditary to multifactorial diseases. However, the development of safe and effective gene delivery systems remains one of the main challenges to its clinical application. Although non-viral delivery systems are less effective than the viral ones, they offer several advantages, when compared to viral vectors, including low immunogenicity, ease in production, stability, and higher capacity to carry nucleic acids. Among non-viral vectors, polymeric-based ones have emerged as promising systems for the transport and delivery of genetic material. These gene carriers are advantageous especially due to their versatility, the number of synthetic methods available and the facile chemical functionalization, which allows the optimization of their structure/activity relationship in order to increase the efficiency of the nanosystem. In this context, the aim of this work was to develop a novel and effective polymeric-based gene delivery system, which would induce a high expression of the transgene with reduced cytotoxicity. Therefore, the biological activity of polyplexes based on poly(2-aminoethyl methacrylate) (PAMA) polymer, with different molecular weights and copolymerized with polyethylene glycol (PEG), was evaluated. Other parameters, such as its cytotoxicity and the ability to condense DNA, were also tested. The results obtained in the presence of serum demonstrated that PEG-b-PAMA block copolymer promotes the formation of polyplexes with higher transfection activity than the corresponding homopolymer PAMA-based polyplexes. The copolymerization with PEG also promoted a decrease of cytoxicity of the polyplexes. Nevertheless, and although the PEG-b- PAMA28900-based polyplexes demonstrated a transfection efficiency much higher than the obtained with the standard reference of the polymer-based systems, the branched poly(ethyleneimine) (bPEI), these nanosystems induced high levels of cytotoxicity, which compromise their in vivo application. Therefore, the ability to transport and deliver genetic material associated to polyplexes based on a combination of different proportions of poly(β-amino ester) (PβAE) and poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) was evaluated. For this purpose, the biological activity and the cytotoxicity of the formulations were evaluated in different cell lines and their mechanism of cellular internalization was also studied. The physicochemical characterization of the most promising formulations was performed in order to obtain the size, surface charge and condensation/protection ability of the DNA. The obtained results demonstrated that the combination of PDMAEMA and PβAE polymers leads to the formation of polyplexes that have the ability to deliver the genetic material into the nucleus. The polyplexes prepared with the combination PDMAEMA: 4PβAE, in the N/P 25/1 ratio, were selected as the best formulation due to their high transfection activity, even in the presence of serum, and their reduced levels of cytotoxicity. In addition, the other experimental studies have demonstrated that these polyplexes based on this combination of polymers are internalized mostly by clathrinmediated endocytosis, promoting the transgene expression in a high percentage of cells. Moreover, these nanosystems present a high protection of genetic material and reduced size, which are suitable physicochemical properties for in vivo applications.