Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/10124
Title: Neuronal dysfunction induced by drugs of abuse
Other Titles: Disfunção neuronal induzida por drogas de abuso
Authors: Oliveira, Maria Teresa Martins da Cunha 
Orientador: Oliveira, Catarina
Rego, Ana Cristina
Keywords: Disfunção neuronal; Droga -- abuso; Neurotoxicidade
Issue Date: 7-Nov-2007
Abstract: O abuso de substâncias e a toxicodependência estão entre as mais dispendiosas desordens neuropsiquiátricas. O abuso repetido de drogas está associado a alterações da actividade neuronal. Neste trabalho estudámos a disfunção neuronal induzida pelas drogas de abuso cocaína, anfetamina e heroína de rua, usando modelos in vitro. O trabalho experimental foi dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo estudámos os efeitos crónicos das drogas de abuso estimulantes, cocaína e da anfetamina e no segundo capítulo estudámos os efeitos crónicos e agudos da heroína de rua. No primeiro capítulo, os efeitos da cocaína e da anfetamina foram avaliados em células PC12, uma linha celular catecolaminérgica, uma vez que os principais alvos dos estimulantes são os sistemas monoaminérgicos. A dopamina, em particular, está associada aos efeitos de recompensa induzidos por todas as drogas de abuso, e é um possível mediador dos efeitos neurotóxicos das drogas de abuso devido ao seu metabolismo oxidativo, que leva à produção de H2O2. Observámos que o tratamento crónico com cocaína (7-12 meses) sensibilizou as células PC12 para a toxicidade aguda da cocaína, o que poderá estar relacionado com o aumento da acumulação extracelular de dopamina induzido por um estímulo agudo com cocaína. A exposição crónica à anfetamina induziu deplecção da dopamina, embora a toxicidade aguda da anfetamina se tivesse mantido nestas células, sugerindo que a dopamina não é necessária para a citotoxicidade aguda da anfetamina. Contudo, as células PC12 tratadas cronicamente com H2O2 apresentaram-se totalmente resistentes à citotoxicidade aguda do H2O2, mas não à citotoxicidade aguda da cocaína ou da anfetamina, sugerindo que a toxicidade aguda destas drogas é independente da adaptação ao stresse oxidativo. Em contraste, as células cronicamente expostas à cocaína ou à anfetamina apresentaram-se parcialmente resistentes ao H2O2, sugerindo que a exposição crónica a estas drogas envolve adaptação ao stresse oxidativo. Assim, estudámos a actividade de enzimas antioxidantes nas etapas iniciais da exposição crónica à cocaína, anfetamina ou H2O2. A cocaína e a anfetamina afectaram de um modo diferente a actividade das enzimas antioxidantes. A cocaína induziu um aumento da actividade da glutationa peroxidase (GPx) após 4 semanas de exposição. A anfetamina apresentou um efeito difásico, com um aumento inicial da actividade da GPx e uma diminuição das actividades da glutationa redutase (GRed) e da superóxido dismutase (SOD), após 3 semanas de exposição. Após 4 semanas de exposição à anfetamina a actividade das enzimas antioxidantes regressou a valores semelhantes ao controlo. A exposição crónica ao H2O2 induziu um aumento gradual da actividade da GPx e uma diminuição da actividade da SOD. A actividade da GRed aumentou após 1 semana de exposição ao H2O2, regressando a valores semelhantes ao controlo após 2 semanas de exposição ao H2O2. Estes resultados indicam que as primeiras etapas de adaptação à cocaína e à anfetamina envolvem alterações da actividade das enzimas antioxidantes, sugerindo uma adaptação ao stresse oxidativo, após exposição crónica a estas drogas de abuso. No segundo capítulo, estudámos os efeitos neurotóxicos da heroína de rua. Os efeitos crónicos da heroína de rua foram avaliados em células PC12. Apesar de os opiáceos não interagirem directamente com os sistemas monoaminérgicos, foi anteriormente demonstrado que as células PC12 apresentam um decréscimo dos níveis intracelulares de dopamina e um aumento dos níveis intracelulares de ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), quando expostas agudamente à heroína de rua. A exposição crónica à heroína de rua sensibilizou as células PC12 para a toxicidade aguda desta droga de abuso, o que pode estar relacionado com um aumento da acumulação extracelular de dopamina induzido pela exposição aguda à heroína de rua nestas células. As células cronicamente expostas à heroína de rua apresentaram um aumento da resistência à toxicidade aguda do H2O2, que se relacionou com a manutenção dos níveis de ATP nestas condições. Contudo, as células cronicamente expostas à heroína de rua apresentaram níveis intracelulares de ATP e ADP mais baixos, o que pode explicar o maior grau de sensibilização destas células a uma exposição aguda à heroína de rua, quando comparadas com as células cronicamente expostas ao H2O2. A neurotransmissão glutamatérgica envolvendo o receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) contribui para a dependência de opiáceos em humanos. Por outro lado, a sobre-activação dos receptores ionotrópicos do glutamato é um dos mecanismos envolvidos na neurotoxicidade e na morte celular. De modo a avaliar a importância do receptor NMDA na citotoxicidade aguda da heroína de rua, utilizaram-se células HEK293 transfectadas com diferentes subunidades do receptor NMDA e neurónios corticais. As células HEK293 foram transfectadas com as subunidades NR1-GFP como controlo, ou NR1/NR2A ou NR1/NR2B. A heroína de rua induziu perda da integridade membranar em células transfectadas com as subunidades NR1/NR2B, e este efeito foi bloqueado pelo maleato de dizocilpina (MK-801), um antagonista dos receptores NMDA, indicando que os receptores NMDA compostos pelas subunidades NR1/NR2B estão envolvidos na neurotoxicidade da heroína de rua. A disfunção do córtex pré-frontal é uma característica importante da toxicodependência, contribuindo para a perda do controlo da impulsividade observada em toxicodependentes. Neste trabalho, determinou-se a composição química da amostra de heroína de rua e estudaram-se as vias apoptóticas envolvidas na neurotoxicidade desta droga de abuso, usada numa concentração que induziu um decréscimo moderado da viabilidade celular. A composição da heroína de rua apresentou 62% de heroína, 12% de 6-monoacetilmorfina e 1% de morfina. Quando usada numa concentração que induziu 10% de perda de viabilidade celular sem perda de integridade membranar, a heroína de rua induziu a activação de caspases da via apoptótica mitocondrial. Foi também observada fragmentação do ADN, que foi prevenida pelo inibidor não-selectivo de caspases z-VAD-fmk. A activação da caspase-3 não foi prevenida por antagonistas dos receptores opióides, antagonistas dos receptores ionotrópicos do glutamato nem por antioxidantes. A activação das caspases pareceu ter sido mediada pela disfunção mitocondrial envolvendo a libertação do citocromo c, a perda de potencial da mitocôndria e um decréscimo da razão Bcl-2/Bax. A heroína pura, na mesma concentração presente na heroína de rua, induziu apenas um pequeno aumento da activação da caspase-3, sugerindo que a activação da caspase-3 é potenciada pela presença da mistura de compostos presentes na heroína de rua. Este resultado indica também que o abuso de heroína impura representa um risco neurotóxico superior. Estes resultados demonstram que as drogas de abuso induzem neurotoxicidade através de vários mecanismos celulares, culminando em stresse oxidativo e disfunção mitocondrial, que poderão representar importantes alvos para futuras estratégias terapêuticas.
Substance abuse and addiction are the most costly of all the neuropsychiatric disorders. The repeated abuse of drugs is associated with changes in neuronal activity. In this work, we studied the neuronal dysfunction induced by the drugs of abuse cocaine, amphetamine and street heroin, using in vitro models. The experimental work was divided into two chapters. In the first chapter we studied the chronic effects of the psychostimulant drugs cocaine and amphetamine, and in the second chapter we studied the chronic and acute effects of street heroin. In first chapter, chronic effects of cocaine and amphetamine were evaluated in PC12 cells, a catecholaminergic cell line, since the main targets of the stimulants are the monoaminergic systems. Dopamine, in particular, is associated with the rewarding effects of all the drugs of abuse, and is a candidate mediator of the neurotoxic effects of the drugs due to its oxidative metabolism, which produces hydrogen peroxide (H2O2). We observed that chronic cocaine treatment (7-12 months) sensitizes PC12 cells to the acute toxicity of cocaine, which may be related to increased cocaineevoked extracellular dopamine accumulation in these cells. Chronic exposure to amphetamine induced dopamine depletion, but amphetamine maintained its acute toxicity in these cells, suggesting that dopamine is not required for acute amphetamine cytotoxicity. However, PC12 cells chronically treated with H2O2 were totally resistant to acute H2O2, but not to acute cocaine or amphetamine exposure, implicating that the acute toxicity induced by these stimulant drugs is unrelated to adaptation to oxidative stress. In contrast, cells chronically exposed to cocaine or amphetamine were partially resistant to H2O2, suggesting that chronic exposure to these drugs involves adaptation to oxidative stress. Therefore, we studied the activity of antioxidant enzymes in the early stages of exposure to cocaine, amphetamine and H2O2. Cocaine and amphetamine differentially affected the activity of the antioxidant enzymes. Cocaine induced an increase in the activity of glutathione peroxidase (GPx) at 4 weeks of exposure. Amphetamine seemed to have a biphasic effect, with an initial increase in GPx activity and a decrease in glutathione reductase (GRed) and superoxide dismutase (SOD) activities (upon 3 weeks of exposure). One week later the activities returned to control levels. Chronic exposure to H2O2 induced a gradual increase in GPx activity and a decrease in SOD activity. GRed activity was increased upon 1 week exposure to H2O2, and returned to control levels after 2 weeks of H2O2 exposure. These data show that changes in the activity of antioxidant enzymes are involved in the chronic effects of cocaine and amphetamine, suggesting that oxidative stress is involved in the chronic effects of these drugs of abuse. In the second chapter we studied the neurotoxic effects of street heroin. Chronic effects of street heroin were also evaluated in PC12 cells. Although opiates do not directly interact with monoaminergic systems, PC12 cells were previously shown to have decreased intracellular dopamine levels and increased intracellular dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) levels, when acutely exposed to street heroin. Chronic exposure to street heroin or H2O2 sensitized PC12 cells to acute street heroin cytotoxicity, which may be related to increased extracellular dopamine accumulation induced by acute street heroin in these cells. Cells chronically exposed to street heroin presented increased resistance to acute H2O2 toxicity, which was correlated with the maintenance of ATP levels in these conditions. However, cells chronically exposed to street heroin presented lower intracellular levels of ATP and ADP, which may explain the higher degree of sensitization of these cells to acute street heroin exposure, when compared to cells chronically exposed to H2O2. Glutamatergic neurotransmission involving the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor has been suggested to contribute to opiate dependence in humans. Moreover, hyperactivation of ionotropic glutamate receptors is one of the mechanisms involved in neurotoxicity and cell death. Taking this into account, we analysed the contribution of NMDA receptor subunits to acute neurotoxicity of street heroin n HEK293 cells, transfected with different subunits of the NMDA receptor, and in cortical neurons. HEK293 cells were transfected with NR1-GFP, as a control, or with NR1/NR2A or NR1/NR2B subunits. Street heroin induced loss of membrane integrity in NR1/NR2B transfected cells, and this effect was blocked by the NMDA receptor antagonist dizocilpine maleate (MK-801), indicating that NR1/NR2B composed receptors are involved in street heroin neurotoxicity. Prefrontal cortex dysfunction is an important event in drug addiction, contributing to the loss of impulse control observed in drug addicts. The chemical composition of the street heroin sample was determined and the apoptotic mechanisms involved in the neurotoxicity of a concentration of street heroin that induced a moderate decrease in cell viability were studied. Street heroin was composed by 62% heroin, 12% 6-monoacetylmorphine (6-MAM) and 1% morphine. In a concentration that induced 10% loss in cell viability without causing loss of membrane integrity, street heroin was shown to activate caspases through the mitochondrial apoptotic pathway. DNA fragmentation was also observed, and was prevented by the non-selective caspase inhibitor z-VAD-fmk. Caspase-3 activation was not prevented by μ-opioid receptor antagonists, ionotropic glutamate receptor antagonists or by antioxidants. The activation of caspases seemed to be mediated by mitochondrial dysfunction involving cytochrome c release, loss of mitochondrial potential and a decrease in Bcl-2/Bax ratio. Pure heroin, in the same concentration found in street heroin, only induced a small increase in caspase-3 activation, suggesting that caspase-3 activation is enhanced by the presence of the cocktail of compounds found in the street heroin sample. This also indicates that the use of impure heroin represents an increased neurotoxic risk. These results show that the drugs of abuse cause neurotoxicity by several intracellular pathways, culminating in oxidative stress and mitochondrial dysfunction, which may represent important targets for future therapeutic strategies for drug addiction.
Description: Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/10124
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat
MTeresaMCunhaOliveira-tese-Doutoramento-2007.pdf3.12 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

137
checked on Sep 17, 2020

Download(s)

112
checked on Sep 17, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.